Sestřih RNA - RNA splicing

Sestřih RNA je proces v molekulární biologii, kde je nově vytvořený transkript prekurzorové messengerové RNA (pre- mRNA ) transformován do zralé messengerové RNA ( mRNA ). Funguje tak, že odstraní introny (nekódující oblasti RNA) a spojí dohromady exony (kódující oblasti). U jaderně kódovaných genů dochází k sestřihu v jádru buď během nebo bezprostředně po transkripci . U těch eukaryotických genů, které obsahují introny, je sestřih obvykle potřeba k vytvoření molekuly mRNA, kterou lze přeložit do proteinu . U mnoha eukaryotických intronů dochází k sestřihu v sérii reakcí, které jsou katalyzovány spliceozomem , komplexem malých nukleárních ribonukleoproteinů ( snRNP ). Existují introny s vlastním sestřihem , tj. Ribozymy, které mohou katalyzovat vlastní excizi ze své mateřské molekuly RNA.

Proces sestřihu RNA

Spojovací cesty

V přírodě se vyskytuje několik metod sestřihu RNA; typ sestřihu závisí na struktuře sestřiženého intronu a katalyzátorech potřebných k tomu, aby ke spojení došlo.

Spliceozomální komplex

Introny

Slovo intron je odvozeno z výrazů intragenní oblast a intracistron , tedy segment DNA, který se nachází mezi dvěma exony genu . Termín intron označuje jak sekvenci DNA v genu, tak odpovídající sekvenci v nezpracovaném transkriptu RNA. Jako součást cesty zpracování RNA jsou introny odstraněny sestřihem RNA buď krátce po transkripci, nebo současně s ní . Introny se nacházejí v genech většiny organismů a mnoha virů. Mohou být lokalizovány v celé řadě genů, včetně těch, které generují proteiny , ribozomální RNA (rRNA) a přenosovou RNA (tRNA).

Uvnitř intronů je pro sestřih vyžadováno donorové místo (5 'konec intronu), místo větvení (blízko 3' konce intronu) a akceptorové místo (3 'konec intronu). Místo donoru sestřihu obsahuje téměř neměnnou sekvenci GU na 5 'konci intronu ve větší, méně vysoce konzervované oblasti. Místo akceptoru sestřihu na 3 'konci intronu ukončuje intron téměř invariantní sekvencí AG. Proti proudu (5'-oddělení) od AG je oblast s vysokým obsahem pyrimidinů (C a U) neboli polypyrimidinový trakt . Dále proti proudu od polypyrimidinového traktu je bod větve, který zahrnuje adeninový nukleotid zapojený do tvorby larev. Konsenzuální sekvence pro intronu (v IUPAC notaci nukleové kyseliny ) je: přehráván GG- [řez] -GURAGU (donorové místo) ... intronové sekvence ... Yurac (větev sekvence 20-50 nukleotidů proti směru od akceptorového místa) ... Y-rich-NCAG- [cut] -G (akceptorové místo). Je však třeba poznamenat, že specifická sekvence intronových sestřihových prvků a počet nukleotidů mezi bodem větve a nejbližším 3 'akceptorovým místem ovlivňuje výběr místa sestřihu. Bodové mutace v podkladové DNA nebo chyby během transkripce mohou aktivovat kryptické místo sestřihu v části transkriptu, který obvykle není spojen. Výsledkem je zralá messengerová RNA s chybějícím úsekem exonu. Tímto způsobem se bodová mutace , která by jinak mohla ovlivnit pouze jednu aminokyselinu, může projevit jako delece nebo zkrácení v konečném proteinu.

Jednoduchá ilustrace exonů a intronů v pre-mRNA

Formace a aktivita

Sestřih je katalyzován spliceosomem , velkým komplexem RNA-protein složeným z pěti malých nukleárních ribonukleoproteinů ( snRNP ). Sestavení a aktivita spliceosomu nastává během transkripce pre-mRNA. Složky RNA snRNP interagují s intronem a podílejí se na katalýze. Byly identifikovány dva typy spliceozomů (hlavní a vedlejší), které obsahují různé snRNP .

  • Mezi hlavní spliceosomu spoje introny, které obsahují GU na 5' místě sestřihu a AG v 3' místa sestřihu. Skládá se ze snRNP U1 , U2 , U4 , U5 a U6 a je aktivní v jádru. Kromě toho je pro sestavení spliceosomu zapotřebí řada proteinů včetně pomocného faktoru 1 malé nukleární RNA U2 (U2AF35), U2AF2 (U2AF65) a SF1 . Spliceozom tvoří během procesu spojování různé komplexy:
  • Komplex E
    • U1 snRNP se váže na sekvenci GU v 5 'místě sestřihu intronu;
    • Spojovací faktor 1 se váže na sekvenci bodů větvení intronu;
    • U2AF1 se váže v 3 'místě sestřihu intronu;
    • U2AF2 se váže na polypyrimidinový trakt;
  • Komplex A (pre-spliceosome)
    • U2 snRNP vytěsňuje SF1 a váže se na sekvenci bodu větvení a ATP se hydrolyzuje;
  • Komplex B (předkatalytický spliceosom)
    • Trimer snRNP U5/U4/U6 se váže a sn5NR U5 váže exony v 5 'místě s vazbou U6 na U2;
  • Komplex B*
    • U1 snRNP se uvolní, U5 se přesouvá z exonu na intron a U6 se váže na 5 'místě sestřihu;
  • Komplex C (katalytický spliceosom)
    • U4 se uvolňuje, U6/U2 katalyzuje transesterifikaci, čímž se 5'-konec intronového ligátu spojí s A na intronu a vytvoří lariat, U5 váže exon na 3 'místě sestřihu a 5' místo se štěpí, což má za následek tvorba lariatu;
  • Komplex C* (post-spliceosomální komplex)
    • U2/U5/U6 zůstávají vázány na lariat a 3 'místo je štěpeno a exony jsou ligovány pomocí hydrolýzy ATP. Sestřihaná RNA se uvolní, lariat se uvolní a degraduje a snRNP se recyklují.
Tento typ spojování se nazývá kanonické sestřih nebo se nazývá lariatická dráha , která představuje více než 99% sestřihu. Naproti tomu, když intronické lemující sekvence nedodržují pravidlo GU-AG, údajně dochází ke nekanonickému sestřihu (viz „menší spliceosom“ níže).
  • Menší spliceosom je velmi podobná hlavní sestřihu, ale místo toho, spojuje se vzácné introny s různými sekvencemi spojovací místa. Zatímco menší a hlavní spliceozomy obsahují stejný U5 snRNP , menší spliceosom má různé, ale funkčně analogické snRNP pro U1, U2, U4 a U6, které se příslušně nazývají U11 , U12 , U4atac a U6atac .

Rekurzivní spojování

Ve většině případů sestřih odstraní introny jako jednotlivé jednotky z transkriptů prekurzorové mRNA . V některých případech, zejména v mRNA s velmi dlouhými introny, však dochází ke spojování v krocích, přičemž část intronu je odstraněna a poté je zbývající intron sestřižen v následujícím kroku. Toto bylo poprvé nalezeno v genu Ultrabithorax ( Ubx ) ovocné mušky, Drosophila melanogaster a několika dalších genech Drosophila , ale byly hlášeny i případy u lidí.

Trans-sestřih

Trans-sestřih je forma sestřihu, která odstraňuje introny nebo outrony a spojuje dva exony, které nejsou ve stejném transkriptu RNA.

Vlastní spojení

Vlastní sestřih se vyskytuje u vzácných intronů, které tvoří ribozym , vykonávající funkce spliceosomu pouze pomocí RNA. Existují tři druhy intronů s vlastním sestřihem, skupina I , skupina II a skupina III . Introny skupiny I a II provádějí sestřih podobný spliceosomu, aniž by vyžadovaly jakýkoli protein. Tato podobnost naznačuje, že introny skupiny I a II mohou evolučně souviset se spliceosomem. Vlastní sestřih může být také velmi starověký a mohl existovat ve světě RNA přítomném před proteinem.

Mechanismus, ve kterém jsou spřaženy introny skupiny I, charakterizují dvě transesterifikace:

  1. 3'OH volného guaninového nukleosidu (nebo jednoho umístěného v intronu) nebo nukleotidového kofaktoru (GMP, GDP, GTP) útočí na fosfát v 5 'místě sestřihu.
  2. 3'OH 5 'exonu se stává nukleofilem a druhá transesterifikace má za následek spojení dvou exonů.

Mechanismus, ve kterém jsou spojeny introny skupiny II (dvě transesterifikační reakce jako introny skupiny I), je následující:

  1. 2'OH konkrétního adenosinu v intronu útočí na 5 'místo sestřihu, čímž vzniká lariat
  2. 3'OH 5 'exonu spouští druhou transesterifikaci v místě spoje 3', čímž se spojí exony dohromady.

sestřih tRNA

tRNA (také tRNA-like) sestřih je další vzácná forma sestřihu, která se obvykle vyskytuje v tRNA. Sestřihová reakce zahrnuje jinou biochemii než spliceozomální a samo-sestřihové dráhy.

V kvasinkách Saccharomyces cerevisiae , kvasinkový tRNA sestřihový endonukleázový heterotetramer, složený z TSEN54 , TSEN2 , TSEN34 a TSEN15 , štěpí pre-tRNA na dvou místech v akceptorové smyčce za vzniku 5'-poloviny tRNA, končící na 2 ', 3'-cyklická fosfodiesterová skupina a 3'-poloviční tRNA, končící na 5'-hydroxylové skupině, spolu s vyřazeným intronem. Kvasinková tRNA kináza pak fosforyluje 5'-hydroxylovou skupinu pomocí adenosintrifosfátu . Kvasinková cyklická fosfodiesteráza tRNA štěpí cyklickou fosfodiesterovou skupinu za vzniku 2'-fosforylovaného 3 'konce. Kvasinková tRNA ligáza přidává skupinu adenosin monofosfátu na 5 'konec 3'-poloviny a spojuje obě poloviny dohromady. 2'-fosfotransferasa závislá na NAD pak odstraní 2'-fosfátovou skupinu.

Vývoj

Spojování se vyskytuje ve všech královstvích nebo oblastech života, nicméně rozsah a druhy spojování se mohou mezi hlavními divizemi velmi lišit. Eukaryoty spojují mnoho messengerových RNA kódujících protein a některé nekódující RNA . Prokaryoty naopak spojují zřídka a většinou nekódující RNA. Dalším důležitým rozdílem mezi těmito dvěma skupinami organismů je, že prokaryotům zcela chybí spliceosomální dráha.

Vzhledem k tomu, že spliceozomální introny nejsou u všech druhů konzervovány, vedou se debaty o tom, kdy se spliceosomální sestřih vyvinul. Byly navrženy dva modely: pozdní intronový a raný intronový model (viz evoluce intronu ).

Spojení rozmanitosti
Eukaryota Prokaryoty
Spliceosomální + -
Vlastní spojení + +
tRNA + +

Biochemický mechanismus

Diagram znázorňující dvoustupňovou biochemii spojování

Spliceozomální sestřih a vlastní sestřih zahrnují dvoustupňový biochemický proces. Oba kroky zahrnují transesterifikační reakce, ke kterým dochází mezi nukleotidy RNA. Sestřih tRNA je však výjimkou a neprobíhá transesterifikací.

Ke spliceozomálním a samoregulačním transesterifikačním reakcím dochází prostřednictvím dvou sekvenčních transesterifikačních reakcí. Za prvé, 2'OH konkrétního rozvětveného nukleotidu uvnitř intronu, definovaného během sestřihu spliceosomu, provádí nukleofilní útok na první nukleotid intronu v místě spoje 5 ', čímž se vytvoří meziprodukt lariatu . Za druhé, 3'OH uvolněného 5 'exonu poté provede nukleofilní útok na první nukleotid následující za posledním nukleotidem intronu v místě spoje 3', čímž se spojí s exony a uvolní intronový lariat.

Alternativní spojování

Hlavní článek: Alternativní spojování

V mnoha případech může proces sestřihu vytvořit řadu unikátních proteinů změnou složení exonu stejné mRNA. Tento jev se pak nazývá alternativní sestřih . Alternativní spojování může nastat mnoha způsoby. Exony lze prodloužit nebo přeskočit, nebo lze introny zachovat. Odhaduje se, že 95% transkriptů z multiexonových genů prochází alternativním sestřihem, přičemž některé případy se vyskytují tkáňově specifickým způsobem a/nebo za specifických buněčných podmínek. Vývoj vysoce výkonné technologie sekvenování mRNA může pomoci kvantifikovat úrovně exprese alternativně sestřižených izoforem. Diferenciální úrovně exprese napříč tkáněmi a buněčnými liniemi umožnily vyvinout výpočetní přístupy k předpovědi funkcí těchto izoforem. Vzhledem k této složitosti je alternativní sestřih transkriptů pre-mRNA regulován systémem trans-působících proteinů (aktivátory a represory), které se vážou na cis-působící místa nebo "prvky" (zesilovače a tlumiče) na samotném transkriptu pre-mRNA. Tyto proteiny a jejich příslušné vazebné prvky podporují nebo snižují využití konkrétního místa sestřihu. Vazebná specificita pochází ze sekvence a struktury cis-prvků, např. V HIV-1 existuje mnoho donorových a akceptorových spojovacích míst. Mezi různými místy sestřihu se ssA7, což je 3 'akceptorové místo, skládá do tří struktur kmenové smyčky, tj. Intronic splicing silencer (ISS), Exonic splicing enhancer (ESE), and Exonic splicing silencer (ESSE3). Struktura řešení tlumiče sestřihu Intronic a jeho interakce s hostitelským proteinem hnRNPA1 poskytuje vhled do specifického rozpoznávání. Avšak ke zvýšení složitosti alternativního sestřihu je třeba poznamenat, že účinky regulačních faktorů jsou mnohokrát závislé na poloze. Například spojovací faktor, který slouží jako aktivátor sestřihu, když je navázán na prvek intronického zesilovače, může sloužit jako represor, když je vázán na svůj spojovací prvek v kontextu exonu, a naopak. Kromě účinků zesilovačů a tlumičů závislých na poloze ovlivňuje sestřih také umístění bodu větve (tj. Vzdálenost proti proudu od nejbližšího 3 'akceptorového místa). Sekundární struktura transkriptu pre-mRNA také hraje roli při regulaci sestřihu, například spojením spojovacích prvků nebo maskováním sekvence, která by jinak sloužila jako vazebný prvek pro sestřihový faktor.

Role sestřihu/alternativního sestřihu v integraci HIV

Proces spojování je spojen s integrací HIV , protože HIV-1 se zaměřuje na vysoce spojené geny.

Sestřihová reakce na poškození DNA

Poškození DNA ovlivňuje sestřihové faktory změnou jejich posttranslační modifikace , lokalizace, exprese a aktivity. Kromě toho poškození DNA často narušuje sestřih interferencí s jeho spojením s transkripcí . Poškození DNA má také dopad na sestřih a alternativní sestřih genů úzce spojených s opravou DNA . Poškození DNA například moduluje alternativní sestřih genů pro opravu DNA Brca1 a Ercc1 .

Experimentální manipulace spojování

Sestřihu mohou být experimentálně změněn vazbou sterické blokování antisense oligonukleotidů , jako jsou morfolino nebo peptidové nukleové kyseliny do vazebných míst snRNP, na branchpoint nukleotidu, který uzavírá lariat, Rozdělit teorie gen nebo na místa sestřihu regulační vazba prvků.

Spojovací chyby a variace

Bylo navrženo, že jedna třetina všech mutací způsobujících onemocnění má dopad na sestřih . Mezi běžné chyby patří:

  • Mutace místa sestřihu vedoucí ke ztrátě funkce tohoto místa. Výsledkem je expozice předčasného stop kodonu , ztráta exonu nebo začlenění intronu.
  • Mutace místa sestřihu snižující specificitu. Může mít za následek odchylku v místě sestřihu, což způsobí inzerci nebo deleci aminokyselin nebo s největší pravděpodobností narušení čtecího rámce .
  • Vytěsnění místa sestřihu, což vede k zahrnutí nebo vyloučení většího počtu RNA, než se očekávalo, což má za následek delší nebo kratší exony.

Ačkoli mnoho chyb spojování je zajištěno mechanismem buněčné kontroly kvality, který se nazývá nesmyslně zprostředkovaný rozpad mRNA (NMD), existuje řada nemocí souvisejících s sestřihem, jak bylo naznačeno výše.

Alelické rozdíly v sestřihu mRNA budou pravděpodobně společným a důležitým zdrojem fenotypové diverzity na molekulární úrovni, navíc k jejich příspěvku k citlivosti genetických chorob. Studie na celém genomu na lidech skutečně identifikovaly řadu genů, které podléhají sestřihu specifickému pro alelu.

V rostlinách kolísala tolerance vůči záplavovému stresu s alternativním sestřihem transkriptů indukovaným stresem spojeným s glukoneogenezí a dalšími procesy.

Spojování bílkovin

Hlavní článek: Spojování bílkovin

Kromě RNA mohou proteiny podstoupit sestřih. Ačkoli jsou biomolekulární mechanismy odlišné, princip je stejný: části proteinu, nazývané interony místo intronů, jsou odstraněny. Zbývající části, nazývané exteiny místo exonů, jsou spojeny dohromady. Sestřih bílkovin byl pozorován u celé řady organismů, včetně bakterií, archea , rostlin, kvasinek a lidí.

Viz také

Reference

externí odkazy