Northern blot - Northern blot
Northern blot , nebo RNA blot, je technika používaná v molekulární biologie výzkumu ke studiu genové exprese detekcí RNA (nebo izolované mRNA ) ve vzorku.
Se Northern blotting je možné pozorovat buněčnou kontrolu nad strukturou a funkcí stanovením konkrétních genových expresních rychlostí během diferenciace a morfogeneze , stejně jako v abnormálních nebo chorobných podmínkách. Northern blotting zahrnuje použití elektroforézy k oddělení vzorků RNA podle velikosti a detekci pomocí hybridizační sondy komplementární k části nebo celé cílové sekvenci. Termín „Northern blot“ ve skutečnosti konkrétně odkazuje na kapilární přenos RNA z elektroforetického gelu na plovací membránu. Celý proces se však běžně označuje jako Northern blot. Techniku Northern blot vyvinuli v roce 1977 James Alwine, David Kemp a George Stark na Stanfordské univerzitě . Northern blotting odvozuje svůj název od podobnosti s první technikou blotování, Southern blot , pojmenovanou pro biologa Edwina Southern . Hlavní rozdíl je v tom, že v Northern blotu je analyzována spíše RNA než DNA .
Postup
Obecný postup blotování začíná extrakcí celkové RNA ze vzorku homogenizované tkáně nebo z buněk. Eukaryotickou mRNA lze poté izolovat použitím oligo (dT) celulózové chromatografie k izolaci pouze těch RNA s poly (A) ocasem . Vzorky RNA se poté oddělí gelovou elektroforézou. Protože jsou gely křehké a sondy nejsou schopny vstoupit do matrice, vzorky RNA, nyní oddělené podle velikosti, jsou přeneseny do nylonové membrány kapilárním nebo vakuovým blotovacím systémem.
Nylonová membrána s kladným nábojem je nejúčinnější pro použití v Northern blotu, protože záporně nabité nukleové kyseliny k nim mají vysokou afinitu. Přenosový pufr použitý pro blotování obvykle obsahuje formamid, protože snižuje teplotu nasedání interakce sonda-RNA, čímž eliminuje potřebu vysokých teplot, které by mohly způsobit degradaci RNA. Jakmile je RNA přenesena na membránu, je imobilizována kovalentní vazbou na membránu UV světlem nebo teplem. Poté, co byla sonda označena, je hybridizována s RNA na membráně. Experimentální podmínky, které mohou ovlivnit účinnost a specifičnost hybridizace, zahrnují iontovou sílu, viskozitu, duplexní délku, neodpovídající páry bází a složení bází. Membrána se promyje, aby se zajistilo, že se sonda specificky vázala, a aby se zabránilo vzniku signálů pozadí. Hybridní signály jsou poté detekovány rentgenovým filmem a mohou být kvantifikovány denzitometrií . K vytvoření kontrol pro srovnání v Northern blotu lze použít vzorky nevykazující požadovaný genový produkt po stanovení pomocí mikročipů nebo RT-PCR .
Gely
Vzorky RNA jsou nejčastěji separovány na agarózových gelech obsahujících formaldehyd jako denaturační činidlo pro RNA pro omezení sekundární struktury. Gely mohou být obarveny ethidiumbromidem (EtBr) a viděny pod ultrafialovým zářením pro sledování kvality a množství RNA před blotováním. Polyakrylamidová gelová elektroforéza s močovinou může být také použita při separaci RNA, ale nejčastěji se používá pro fragmentovanou RNA nebo mikroRNA. Spolu se vzorky se na elektroforetickém gelu často vede RNA žebřík, aby se pozorovala velikost získaných fragmentů, ale ve vzorcích celkové RNA mohou ribozomální podjednotky působit jako markery velikosti. Vzhledem k tomu, že velká ribozomální podjednotka je 28S (přibližně 5 kB) a malá ribozomální podjednotka je 18S (přibližně 2 kB), objevují se na gelu dva prominentní pásy, čím větší je téměř dvojnásobek intenzity menší.
Sondy
Sondy pro Northern blot jsou složeny z nukleových kyselin s komplementární sekvencí k celé nebo části požadované RNA, mohou to být DNA, RNA nebo oligonukleotidy s minimálně 25 komplementárními bázemi k cílové sekvenci. Sondy RNA (riboprobe), které jsou transkribovány in vitro, jsou schopné odolat přísnějším promývacím krokům, které zabraňují některým hlukům v pozadí. Obvykle se cDNA vytváří se značenými primery pro sledovanou sekvenci RNA, která působí jako sonda v Northern blotu. Sondy musí být označeny buď radioaktivními izotopy ( 32 P), nebo chemiluminiscencí, ve které alkalická fosfatáza nebo křenová peroxidáza (HRP) rozkládají chemiluminiscenční substráty za vzniku detekovatelné emise světla. Chemiluminiscenční značení může nastat dvěma způsoby: buď je sonda připojena k enzymu, nebo je sonda označena ligandem (např. Biotinem ), pro který je ligand (např. Avidin nebo streptavidin ) připojen k enzymu (např. HRP) . Rentgenový film může detekovat radioaktivní i chemiluminiscenční signály a mnoho výzkumníků dává přednost chemiluminiscenčním signálům, protože jsou rychlejší, citlivější a snižují zdravotní rizika spojená s radioaktivními značkami. Stejnou membránu lze sondovat až pětkrát bez významné ztráty cílové RNA.
Aplikace
Northern blotting umožňuje pozorovat expresní schéma konkrétního genu mezi tkáněmi, orgány, vývojovými stádii, úrovní stresu prostředí, infekcí patogeny a v průběhu léčby. Tato technika byla použita k ukázání nadměrné exprese onkogenů a downregulace nádorových supresorových genů v rakovinných buňkách ve srovnání s 'normální' tkání, stejně jako genové exprese při odmítnutí transplantovaných orgánů. Je -li pozorován upregulovaný gen množstvím mRNA na Northern blot, vzorek může být sekvenován, aby se zjistilo, zda je gen vědcům znám nebo zda se jedná o nový nález. Expresní vzorce získané za daných podmínek mohou poskytnout vhled do funkce tohoto genu. Protože je RNA nejprve oddělena velikostí, pokud je použit pouze jeden typ sondy, může odchylka v úrovni každého pásu na membráně poskytnout vhled do velikosti produktu, což naznačuje alternativní sestřihové produkty stejného genu nebo motivy opakující se sekvence. Rozptyl ve velikosti genového produktu může také indikovat delece nebo chyby při zpracování transkriptů. Změnou cíle sondy použitého podél známé sekvence je možné určit, která oblast RNA chybí.
Výhody a nevýhody
Analýzu genové exprese lze provést několika různými způsoby, včetně RT-PCR, ochranných testů RNázy, mikročipů, RNA-Seq , sériové analýzy genové exprese (SAGE) a také Northern blotting. Mikročipy se používají zcela běžně a jsou obvykle v souladu s údaji získanými ze severních blotů; Northern blotting je však někdy schopen detekovat malé změny v genové expresi, které mikročipy neumí. Výhodou, kterou mají mikročipy oproti Northern blotům, je to, že lze najednou zobrazit tisíce genů, zatímco Northern blotting se obvykle zaměřuje na jeden nebo malý počet genů.
Problémem při Northern blottingu je často degradace vzorku RNázami (jak endogenními pro vzorek, tak prostřednictvím kontaminace životního prostředí), čemuž lze zabránit správnou sterilizací skleněného nádobí a použitím inhibitorů RNázy, jako je DEPC ( diethylpyrokarbonát ). Chemikálie používané ve většině severních blotů mohou být pro výzkumníka rizikem, protože formaldehyd, radioaktivní materiál, ethidiumbromid, DEPC a UV světlo jsou při určitých expozicích škodlivé. Northern blot má ve srovnání s RT-PCR nízkou citlivost, ale také vysokou specificitu, což je důležité pro snížení falešně pozitivních výsledků.
Mezi výhody použití Northern blotting patří detekce velikosti RNA, pozorování alternativních produktů sestřihu, použití sond s částečnou homologií, kvalitu a množství RNA lze měřit na gelu před blotováním a membrány lze skladovat a odmítali roky po blotování.
Pro Northern blot pro detekci mRNA acetylcholinesterázy byla neradioaktivní technika porovnána s radioaktivní technikou a shledána stejně citlivou jako radioaktivní, ale nevyžaduje žádnou ochranu před zářením a je časově méně náročná.
Reverzní severní blot
Vědci příležitostně používají variantu postupu známou jako reverzní Northern blot. V tomto postupu je substrátová nukleová kyselina (která je připevněna k membráně) sbírkou izolovaných fragmentů DNA a sonda je RNA extrahována z tkáně a radioaktivně značena. Použití mikročipů DNA, které se začaly široce používat na konci devadesátých a na počátku dvacátých let minulého století, se více podobá opačnému postupu, protože zahrnují použití izolovaných fragmentů DNA připevněných k substrátu a hybridizaci pomocí sondy vyrobené z buněčné RNA . Reverzní postup, přestože byl původně neobvyklý, umožnil severní analýze vyvinout se do profilování genové exprese , ve kterém může být sledována exprese mnoha (možná všech) genů v organismu.
Viz také
- Western blot
- Eastern blot
- Severozápadní skvrna
- Dálný východ Blot
- Far-western blot
- Diferenciální zobrazení
Reference
externí odkazy
|
Knihovní zdroje o Northern blot |